Регистрация сигнальных молекул - реферат

содержание

стр.

Перечень сокращений

введение

1. обзор литературы

1.1. Внедрение Ti-плазмид агробактерий в генетической инженерии

1.1.1. Короткая черта Agrobacterium tumefaciens

1.1.2. Cоздание векторов на базе Ti-плазмид

1.1.3. Процессинг тДНК в бактериальной клеточке

и ее перенос в клеточки растений

1.1.4. Разработка система трансформаций растений с

помощью Agrobacterium tumefaciens

1.1.5. Неувязка сохранения чужеродных генов,

перенесенных в растение

1.1.6. Анализ экспрессии чужеродных генов в трансформированных растениях

1.2. Внедрение способа генетической Регистрация сигнальных молекул - реферат

инженерии для трансформации однодольных растений

1.2.1. Короткие свойства ряски

1.3. Сигнальные молекулы, их способность индуцировать процессинг тДНК

2. Материалы и способы

2.1. Материалы

2.1.1. Оборудование

2.1.2. Бактериальные штаммы и плазмиды

2.1.3. Растения

2.1.4. Среды микробиологические для

культивирования растений

2.1.5. Другие смеси

2.1.6. Ферменты, применяемые в генной инженерии

2.1.7. Лекарства

2.2. Способы

2.2.1. Инкубация Agrobacterium tumefaciens с

экссудатами тканей растений

2.2.2. Выделение полной ДНК Agrobacterium tumefaciens

2.2.3. Блод-гибридизация тДНК по Саузерну

2.2.4. Трансформация клеток Esherichia coli

3. результаты

4. обсуждение

5. выводы

литературы

приложение


Перечень СОкРАЩЕНИЙ

НУК – нафтиуксусная кислота

БАП – бензиламинопурин

MS –

LB –

тДНК –

Ар – ампицилин

Cs Регистрация сигнальных молекул - реферат – цефотоксин


ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы:

Свойство микробов вида Agrobacterium tumefaciens вызывать у растений корончато-галловую болезнь связано с присутствием в их клеточках больших (95-156 мДа) конъюгированных Ti-плазмид (от англ. tumor-inducing – вызывающий опухоль). В процессе идентифицирования растений часть генетического материала Ti-плазмид – тДНК (от англ. transferred DNA – передаваемая) перемещается в растительные Регистрация сигнальных молекул - реферат клеточки и встраивается в хромосомы, оставаясь частью наследного материала. Гены тДНК экспрессируются в трансформарованных растительных клеточках, нарушают их фитогормональный баланс и определяют синтез специфичных ------- соединений.

Таким макаром, агробактерии являются природными "генными инженерами", осуществляющий поразительный по филогенетической дальности перенос генетической инфы. На базе агробактерий сконструированы действенные векторные системы Регистрация сигнальных молекул - реферат для генетической инженерии растений.

Агробактириальная трансформация происходит в итоге сложного процесса взаимодействия меж бактериальными и растительными клеточками. В этом процессе одной из решающих стадий является рецепция агробактериями особенных сигнальных молекул, присутствующих в экссудатах покоробленных тканей растений. Сигнальные молекулы индуцируют экспрессию генов области vir (агробактериальных Ti-плазмид), контролирующих вырезание тДНК Регистрация сигнальных молекул - реферат и ее перенос в клеточки растений. Агробактерильная трансформация наблюдается у широкого круга голосеменных и двудольных растений, но, она отмечена только у очень малозначительного числа однодольных растений. Одной из обстоятельств ограничений агробактериальной трансформации однодольных считается присутствие в их клеточках сигнальных молекул, индуцирующих процессинг и перенос тДНК.

Цель работы:

В текущее время Регистрация сигнальных молекул - реферат имеются противоречивые данные относительно наличия таких сигнальных молекул у однодольных растений. В связи с этим, целью данной работы был анализ ряски на присутствие у их сигнальных молекул, индуцирующих процессинг тДНК.


1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Внедрение Ti-плазмид агробактерий в генетической инженерии растений

1.1.1. Короткая черта Agrobacterium tumefaciens

За последнее десятилетие в области генетической Регистрация сигнальных молекул - реферат инженерии растений достигнуты значимые успехи. Были разработаны различные способы генетической трансформации и, в текущее время осуществлена экспрессия чужеродных генов в растениях многих видов. Более принципиальным для развития генетической инженерии растений было открытие молекулярных основ опухолевых образований при помощи Agrobacterium tumefaciens [7].

Вирулентные штаммы Agrobacterium tumefaciens (сем. Rirobiaceae) характеризуются присутствием в Регистрация сигнальных молекул - реферат клеточках большой плазмиды, так именуемой Ti-плазмиды, весом более 150 т.п.н. (см. Приложение) [9].

Агробактерии вызывают опухолевый рост у многих двудольных и голосеменных, а так же у неких однодольных растений [2,3]. Для инфицирования in vivo нужно повреждение тканей растения [12].

После прикрепления к клеточной стене растительной клеточки агробактерии переносят часть Ti-плазмиды (так именуемой Регистрация сигнальных молекул - реферат тДНК) в ядро, где происходит ее размеренная интеграция в хромосому растения.

Подтверждено, что функция определения клеток и прикрепления к ним, а так же вырезание, перенос и, может быть, интеграция тДНК в растительный геном кодируется 2-мя хромосомными генами – Chva и Chvb [13] и рядом генов vir-области, находящихся на Регистрация сигнальных молекул - реферат Ti-плазмиде [14].

После переноса в ядро растительной клеточки, тДНК может интегрировать в геном в виде одной либо нескольких копий [15]. Интегрированная тДНК имеет характеристики, соответствующие для ДНК эукариот, что показано в опытах по гиперчувствительности к ДНК-азе I (Schafer, 1984). Зависимо от типа Ti-плазмиды, в тДНК находится от 7 до 13-ти Регистрация сигнальных молекул - реферат генов, ответственных за опухолевый фенотип. Гены 1 и 2 кодируют ферменты, участвующие в синтезе ауксина, индолилуксусной кислоты, в то время, как ген 4 кодирует изопентенилтрансферазу, синтезирующую цитокинин изопентенила денозин 5'-монофосфат [16].

Одновременная транскрипция генов 1,2 и 4 приводит к увеличению уровня фитогормонов снутри трансформированных клеток. Результатом этого является увеличение митотической активности и образование опухоли. Другие гены тДНК Регистрация сигнальных молекул - реферат кодируют синтез так именуемых опинов, из которых более исследованы нопапин и октопин. Опины представляет собой производное аминокислот и сахаров, которые служат источником питания для агробактерий [14]. В целом, образование корончатого галла представляет собой отлично охарактеризованный пример генетической инженерии растений в природе.

Мутации в вирулентных генах агробактерий . Наличие Ti-плазмид Регистрация сигнальных молекул - реферат в клеточках агробактерий является полностью нужным условием патогенности мельчайшего организма. Излеченные от Ti-плазмид штаммы агробактерий авирулентны. На вирулентность Agrobacterium tumefaciens влияют разные мутации, картируемые как на опухолевых плазмидах, так и на хромосомах. Ранешние этапы взаимодействия агробактерий с растениями, так же как хемотаксис, прикрепление к поверхности растительной Регистрация сигнальных молекул - реферат клеточки и специфичное связывание в центрах инфекции контролируются генами, имеющими хромосомную локализацию. В хромосоме размещены некие гены, регулирующие экспрессию vir-генов Ti-плазмид [19]. Присоединение агробактерий к клеточкам растения является одним из первых шагов, определяющих действенное взаимодействие. Этот шаг у Agrobacterium tumefaciens держут под контролем два связанных меж собой хромосомных локуса Регистрация сигнальных молекул - реферат Chva и Chvb, размерами 1,5 kb и 5kb, соответственно [Дуглас и др, 1985]. Гены этих локусов экспрессируются конститутивно. В итоге транспозонного мутагенеза этих областей получают авирулентные либо дефекнтые по прикреплению агробактерии. Мутации в этих локусах очень снижают либо ингибируют вирулентность бактерии, но не для всех владельцев. Локус Chvb определяет синтез Регистрация сигнальных молекул - реферат нейтрального повторяющегося b-D-гликана, который трансформируется в периплазматическое место клеточки при помощи продукта гена Chva. Роль нейтрального b-D-гликана в заразном процессе еще точно не установлена. Кроме повторяющегося b-D-гликана в прикреплении патогенных агробактерий к растительным клеточкам учавствуют и другие полисахариды, а именно внеклеточные экзополисахариды.

Организация Регистрация сигнальных молекул - реферат vir- генов Ti-плазмид . Вирулентные гены агробактерий на Ti- и Ri-плазмидах кластеризованы в области vir разметом около 30-35 kb, проявляющей в этих плазмидах значительную гомологию ДНК. Выявлена также гомология vir-генов Ti-плазмид Agrobacterium tumefaciens с tra-генами конъюгитивных плазмид. В ----- Ti-плазмидах в области vir локализовано 6 разных групп комплементации A Регистрация сигнальных молекул - реферат, B, C, D, E и G, организованных в единый регулон [Stachel Nester, 1986]. Октопиновая Ti-плазмида Arh 5 имеет дополнительный локус vir F, расположенный справа от локуса vir E [Kooykaas et al., 1984]. Мутации в генах и --------- vir A, vir G, vir B и vir D присваивают агробактериям авирулентный фенотип, в отличие от Регистрация сигнальных молекул - реферат большинства хромосомных мутаций, имеющих круг трансформируемых растений-хозяев.

Продукты генов vir-области держут под контролем процессинг тДНК в бактериальной клеточке, ее перенос в растительную клеточку и интеграцию в ядерный геном растения, при этом эти процессы гены vir могут определять не только лишь в цис, да и в Регистрация сигнальных молекул - реферат транс положении по отношению к тДНК (другими словами находясь в различных репликонах). Исходя из этого характеристики области vir, сконструированы и удачно употребляются в практике комфортные бинарные векторы для генетической инженерии растений [Дрейпер с соавт, 1991]. Для процессов "вырезания" тДНК из плазмиды (поточнее, высвобождения в процессе репликативного синтеза) и ее переноса Регистрация сигнальных молекул - реферат в растение нужно фланкирование этой области особенными границами: неидеальными прямыми циклическими последовательностями ДНК размером 24 ---- , проявляющими значительную гомологию у всех изученных Ti- и Ri-плазмид. Границы тДНК гомологичны области oriT конъюгативных плазмид. В этой области сайт-специфические эндонуклеазы создают одноцепочечный разрыв, служащий началом репликации по типу разматывающегося рулона, происходящей в процессе Регистрация сигнальных молекул - реферат транспорта плазмиды. Репликация обеспечивает сохранение плазмиды в материнской клеточке и возникновение ее копии в дочерней.

Для обычного процессинга тДНК и ее переноса в растительную клеточку в особенности принципиальна ее правая граница, которая одна может определять полярность переноса тДНК. Удаление правой границы из Ti-плазмид делает агробактерии вполне Регистрация сигнальных молекул - реферат авирулентными. Подмена ее на искусственно синтезированную, так же как и на левую, восстанавливает вирулентность мельчайшего организма.

На процессинг тДНК в клеточках микробов оказывают влияние мутации в генах vir D, vir C и vir E – оперонов, на транспорт т-комплекса в растительную клеточку – мутации в генах vir B и vir D – оперонов Регистрация сигнальных молекул - реферат.

1.1.2. Создание векторов на базе Ti-плазмид

Сначала 80-х годов были изготовлены 1-ые пробы перенести чужеродные последовательности ДНК в растительные клеточки или при помощи транспозонного мутагенеза [Uernals-teens et al., 1980], или методом сайт-специфической передвижения генов в тДНК и следующей двойной рекомбинацией с Ti-плазмидой одичавшего типа [Matrke Регистрация сигнальных молекул - реферат et al., 1981; leemans et al., 1981]. Но, эти ранешние опыты, основанные на двойной рекомбинации, занимали много времени, были достаточно сложны и трансформации проходили с очень низкой частотой. Нужно было создать более действенные векторы, чтоб облегчить генетические манипуляции с микробами и позволить селекцию и регенерацию трансформатов.

На данный момент употребляют две Регистрация сигнальных молекул - реферат принципно различные системы для введения чужеродных генов в растения при помощи Ti-плазмид:

1. ---- векторы

2. бинарные векторы.

В базе сотворения -------- векторов лежит тот факт, что гены тДНК не ------- для растительных клеток, и неважно какая последовтельность ДНК, интегрированная меж границами тДНК, может интегрировать в хромосому растительной клеточки и нормально там экспрессироваться [Zambryski et al., 1983]. В Регистрация сигнальных молекул - реферат -------- векторых системах тДНК можно поменять, к примеру, на последовательность pBR322, а чужеродную ДНК, которую подразумевается перенести в растения, необходимо проклонировать в этом же векторе.

Потом методом гомологичной рекомбинации эта чужеродная ДНК может быть перенесена на Ti-плазмиду реципиентного штамма агробактерии (рис. 2). Одним из первых таких векторов Регистрация сигнальных молекул - реферат на основании Ti-плазмид авляется pGV3850 [Zambryski et al., 1983]. В нем все гены, ответственные за синтез фитогормонов, были изменены на последовательность pBR322.

ДНК pBR322 обеспечивала гомологию для ------- области тДНК pGV3850 с хоть какими производыми pBR, несущими клонированный ген.

Гены, кодирующие разные маркерные белки для резвого отбора трансгенных растений, были интегрированы Регистрация сигнальных молекул - реферат в pGV3850 [De Blocle, 1984]. Была разработана система трехродительного скрещивания для переноса всех производных pBR322 из E. coli в A. tumefaciens pGV3850 [Van Haute et al., 1983]. В текущее время сконструированы и удачно употребляются и другие --- ---------- векторы на базе Ti-плазмид [Royers et al., 1988].


Рис. 2.

Схемы -------- (А) и бинарной (Б Регистрация сигнальных молекул - реферат) векторных систем. vir – область вирулентности. HOM – области гомологии, в границах которых может происходить рекомбинация, приводящая к образованию коинтегратов. LB и RB – левая и правая границы тДНК. MCS - ----- веб-сайт для клонирования. РТМ – маркет трансформации для растений. RES – маркер стойкости к антибиотику для микробов. OriT – начало переноса и bom-сайт для мобилизации Регистрация сигнальных молекул - реферат векторов при конъюгации. Col E1 – начало репликации из плазмиды Col E1. RK2 – начало репликации из плазмиды широкого круга владельцев RK2.


Система бинарных векторов базирована на том, что область тДНК и гены vir могут распологаться на различных плазмидах [Hockemu et al., 1983]. В таких системах обычно находятся два элемента:

1) Ti-плазмида-помощник Регистрация сигнальных молекул - реферат, в какой тДНК польностью делетирована. Эта плазмида несет в собственном составе гены vir, действующие in trans.

2) Плазмида широкого круга владельцев, имеющая веб-сайты для клонирования и маркерные гены для селекции растений, ограниченные правой и левой фланкирующими последовательностями тДНК [An et al., 1988] рис

Обе описанные выше системы векторов подразумевают Регистрация сигнальных молекул - реферат --------- шагах сборку подходящих конструкций в промежных векторах, к примеру в pAP2034 [Veltena, Sehell., 1987] либо pRT103 [Topter et al., 1983] а потом перенос из в готовом виде в рецепиентные штаммы агробактерий.

1.1.3. Процессинг тДНК в бактериальной клеточке

и ее перенос в клеточки растений

Формы процессированной тДНК. При культивировании Agrobacterium tumefaciens с механически Регистрация сигнальных молекул - реферат покоробленными частями растений, регенерирующими протопластами либо в присутствии --------- из клеток микробов можно выделить разные молекулярные формы процессированной тДНК – одноцепочечные линейные, двуцепочечные линейные и двуцепочечные кольцевые, которые могут претендовать на роль посредника в переносе генетического материала в растительную клеточку [-------, 1980]. При этом кольцевая форма, образующаяся за счет гомологичной рекомбинации меж правой и Регистрация сигнальных молекул - реферат левой границей тДНК с образованием одной гибридной границы, встречается в очень малых количествах. При ее образовании не происходит репликативного синтеза ДНК, в то время как в случае образования 2-ух других форм, может быть прохождение репликации тДНК в бактериах в процессе ее транспотра в растения (к возникновению одноцепочечных форм может Регистрация сигнальных молекул - реферат приводить прерывание, ингибирование прерывающегося синтеза запаздывающей цепи). Репликация призвана обеспечить сохранение тДНК в начальной Ti-плазмиде, если только не допустить возможность существования физического вырезания материала тДНК из Ti-плазмид за счет образования двухцепочечных разрывов в границах. Исчезновение тДНК из Ti-плазмид является основным недочетом отошедшей на 2-ой Регистрация сигнальных молекул - реферат план схожей "эксцезионной модели". Все же, образование двуцепочечных разрывов снутри границ и возникновение детектируемых количеств линейной двуцепочечной формы тДНК при культивировании бактериальных клеток в присутствии ---------- исследователи следили уже через 30 минут после прибавления этого индуктора в среду. Так же в критериях индукции vir-генов --------- в клеточках агробактерий находится линейная одноцепочечная Регистрация сигнальных молекул - реферат форма процессированной тДНК [Stachel et al., 1986].

Возникновение этого интермедиата находится через восемь часов после прибавления индуктора, и его количество скапливается в протяжении следующих 40 часов более, чем вдвое, а потом идет на убыль, демонстрируя, что процесс лимитирован.

Какая из форм транслоцируется через бактериальную мембрану в бактериальную клеточку до сего времени остается Регистрация сигнальных молекул - реферат не выясненным из-за трудности определения относительного количества каждой из форм и выявления динамики их перевоплощения. Может быть, процессинг и транспорт тДНК не разобщены во времени и идут сопряженно подобно конъюгационному переносу плазмид, происходящему в месте контакта мембран конъюгирующих клеток [Clark and Warren, 1979]. Тогда все обнаруживаемые интермедиаты могут быть аберрантными формами Регистрация сигнальных молекул - реферат прерванного на каком-то шаге неразделимого процесса (либо некорректно завершенного). В случае индуцированной экспрессии vir-генов ------- отсутствует главный элемент взаимодействия – контакт бактериальной клеточки и растительной клеточки, и, потому, все обнаруживаемые в данном случае формы могут претендовать на роль посредника только с определенными допущениями. Достоверно понятно, что в Регистрация сигнальных молекул - реферат растительную клеточку попадает только одна цепь тДНК и конвертируется в двуцепочечную уже в растительной клеточке. Дискуссируется, что в случае прохождения в клеточке Agrobacterium tumefaciens -------- полуконсервативной репликации тДНК 2-ая цепь может в процессе переноса гидролизоваться, высвобождая энергию для транспорта переносимой цепи.

1.1.4. Разработка система трансформаций растений с

помощью Agrobacterium tumefaciens

Большая Регистрация сигнальных молекул - реферат часть начальных экспериметнов по генетической трансформации растений было предпринято при помощи инфецирования пораненных растительных клеток при помощи агробактерий с немодифицированными Ti-плазмидами. Для сохранения стерильности нередко инфицировали эксплантаты in vitro заместо целых растений. Бактерии потом удаляли, добавляли в среду цефотоксин либо карбенициллин. Трансформанты отбирали на безгормональной среде.

В предстоящем по мере Регистрация сигнальных молекул - реферат сотворения обезоруженных векторов и новых селективных маркеров, был разработан более действенный способ, дающий огромное число трансформантов: кокультивирование агробактерий с растительными протопластами или с эксплантантами листьев. Было показано, что кокультивирование протопластов с агробактериями, или с бактериальными --------, приводит к образованию опухоли [Marton et al., 1979, Wullems et al., 1981]. Потом схожий подход был Регистрация сигнальных молекул - реферат удачно использован для трансформации растительных клеток агробактериями, несущими в составе тДНК химерные селективные маркеры [Fraley et al., 1983, Herrera-Estrella et al., 1983].

Этот способ был в предстоящем улучшен внедрением так именуемых фидерных культур [Fraley et al., 1983]. Но, все перечисленные способы применимы только для трансформации растений, которые можно просто регенерировать из Регистрация сигнальных молекул - реферат протопластов (к примеру, табак и петуния). Эту делему мрожно просто преодолеть кокультивируя агробактерии с листовыми дисками заместо протопластов [Horch et al., 1985; Rogers et al., 1986; Lloyd et al., 1986]. Стерильные листовые диски --------- с агробактериями, несущими в составе обезоруженного вектора какой-нибудь селективный маркер стойкости к антибиотику. Потом куски листьев Регистрация сигнальных молекул - реферат культивируют два денька на фидерных чашечках со средой для образования побегов. После чего их переносят на среду с цефотоксином для поражения микробов и с любым антибиотиком (к примеру, с ---------) для отбора трансформантов. Регенерировавшие побеги дают корешки, после этого растения переносят в почву для проведения последующих тестов.

Так как Регистрация сигнальных молекул - реферат способ трансформации листовых дисков представляет собой безупречное сочетание высочайшей частоты трансформации с легкой и резвой ------- и регенерацией трансформантов, этот подход стали использовать в почти всех лабораториях мира. Не считая того были предложены некие модификации способа. Для увеличения частоты трансформации листовых дисков Arabiodopsis было предложено обрабатывать агробактерии --------- [Sheikholeskam a. Week S, 1987], который является Регистрация сигнальных молекул - реферат индуктором генов vir [Stachel et al., 1985]. Но способ трансформации листовых дисков применим для трансформации только тех видов растений, которые могут регенерировать побеги из недифференцированных клеток в месте поранения.

Вместе с способом трансформации листовых дисков обширно употребляются конъюгированные агробактерии со стеблевыми секторами [An et al., 1986], клеточками суспензированной Регистрация сигнальных молекул - реферат культуры [Scott a. Draper, 1987], микрокаллусами [Pollock et al, 1985] и прорастающими семенами [Feldmam a. Markis, 1987]. Способ трансформации семян агробактериями был в первый раз использован для арабидопсиса и заслуживает особенного внимания, потому что не просит работы с культурой ткани.

1.1.5. Неувязка сохранения чужеродных генов, перенесенных в растение

Чужеродные ДНК, перенесенные в растительные клеточки Регистрация сигнальных молекул - реферат при помощи разных способов, обычно встраиваются в ядерный геном и наследуются в согласовании с законами Менделя [De Block et al., 1984; Horsch et al., 1984]. Области ингерации, по видимому, распределены случайным образом по геному. Встраивание генов по определенным веб-сайтам было ранее описано в системах животных клеток [Smithies et al., 1985; Maniatis Регистрация сигнальных молекул - реферат, 1985] и не так давно схожий подход был удачно использован для трансформации растений [Paszkowski et al., 1988].

Почти всегда последовательности чужеродной ДНК встраиваются в один локус или в одной копии, или в виде кластера тандемных вставок, что было показано при помощи гибридизации in situ [Mouras et al., 1986]. Но, нередко наблюдаются множественные вставки в Регистрация сигнальных молекул - реферат два либо более участков на различных хромосомах [De Block et al., 1984; Peerbolte et al., 1986a, b; Feldmann a. Marus, 1987]. В связи с этим в почти всех случах была получена контрансформация на физическом уровне несцепленных генов, сегрегация неких проходила в поколении F1 [De Framond et al., 1986; Simpson et al., 1986].

Чужеродыне Регистрация сигнальных молекул - реферат гены обычно передаются потомству с высочайшей степенью стабильности при мейозе [Muller et al., 1987]. Но, время от времени следили случайную утрату трансформированного фенотипа после мейоза [Potrykus et al., 1989].

Возмножно, это происходило из-за активации чужеродного гена (к примеру, при метилировании ДНК). Интеграция чужеродной ДНК во внеядерные геномы, к примеру Регистрация сигнальных молекул - реферат, в хлоропластную ДНК [De Block et al., 1980], так же происходит по неменделевскому типу наследования – по материнской полосы.

Используя способ гибридизации по Саузерну [Southern, 1975] для анализа трансформантов и их потомства, многие исследователи проявили, что нередко наблюдается встраивание укороченных, тандемных либо перестроенных копий чужеродных генов, в особенности после прямого переноса ДНК в Регистрация сигнальных молекул - реферат протопласты [Krens et al., 1985]. Возникновение тандемов, нередко от 5 до 20 копий, можно разъяснить рядом рекомбинаций перед интеграцией в геном [Szernilofsky et al., 1986; Wirtz et al., 1987]. Образование инвертированных повторов является главным типом перестроек чужеродной ДНК при применении векторов, содержащих тДНК ----- Ti-плазмиды [Jorgensen et al., 1987].

Итак, при проведении опытов Регистрация сигнальных молекул - реферат по трансформации растений, нужно принимать во внимание тот факт, что чужеродная ДНК может подвергаться разным модификациям перед встраиванием в геном владельца. Но, и после интеграции могут происходить разные ее перестройки, обычно во время мейоза [Czernilofsky et al., 1986]. В таких случаях только перекрестное опыление кропотливо отобранных трансформантов с более хотимым генотипом и Регистрация сигнальных молекул - реферат фенотипом дает потомство с прогнозируемыми призанаками.

1.1.6. Анализ экспрессии чужеродных генов в трансформированных растениях

Для высококачественного и количественного анализа экспрессии чужеродных генов в растениях употребляют огромное количество способов, включая Нозери-анализ РНК [Nagy et al., 1988] и Вестери-анализ товаров трансдукции [Burnette, 1981]. Не считая того, изучают фенотипические признаки такие как Регистрация сигнальных молекул - реферат, устойчивость к лекарствам и гербицидам. Для анализа экспрессии таких репортерных генов, как cat, npt II, гены октопин- и -------- разработаны чувствительные способы [Otten a. Schilperoort, 1987; Gorman et al., 1982].

Такового рода анализ может иметь огромное значение, так как можно сочетать кодирующие последовательности репортерных генов с подходящими регуляторными последовательностями растительных генов, или создавать двойные гены Регистрация сигнальных молекул - реферат, экспрессирующиеся с 1-го и такого же промотора. Активность гена и промотора можно таким макаром найти или при помощи ферментативного анализа, или гибридизацией растительной РНК с зондами, комплементарными репортерному гену.

Вышеперечисленные различные методики можно удачно использовать для анализа экспрессии чужеродных генов в трансгенных растениях, а именно, генов стойкости к гербицидам Регистрация сигнальных молекул - реферат, насекомым, облучению, лекарствам и др.

1.2. Внедрение способа генетической

инженерии для трансформации однодольных растений

1.2.1. Короткие свойства ряски

Семейство рясковые, Lemnaceae включает 6 родов и 30 видов, встречающихся на всех материках. Более обширно они всераспространены в Северной и Южной Америке, Африке, Австралии. Представители семейства рясковые являются самыми малеханькими в мире цветковыми растениями, венчики которых изредка Регистрация сигнальных молекул - реферат превосходят 1 см. В итоге гидрофильной эволюции они достигнули последней степени редукции всех собственных органов, потому и по простоте строения занимают 1-ое место посреди цветковых.

Рясковые – водные, свободноплавающие, большей частью долголетние травянистые растения. По собственной природе рясковые являются неотеническими формами произошедшими от протцов современного водоплавающего рода Пистия Регистрация сигнальных молекул - реферат из семейства Ароидных . Рясковые служат кормом для одичавших и домашних уток, а так же других водоплавающих и болотных птиц, для рыб, в особенности карпа, и ондатры. В сельском хозяйстве их употребляют в свежайшем и сушеном виде как ценный белковый корм для свиней и домашней птицы. Используются рясковые и для чистки воды Регистрация сигнальных молекул - реферат, потому что извлекают из нее и припасают в собственных листьях азот, фосфор, калий, а так же поглощиют углекислый газ и обогащают воду кислородом. Употребляются и человеком.

За последние 50 лет рясковые рассматриваются, как очень ценный экспериментальный объект для морфогенетических, физиологических и биохимических исследовательских работ благодаря неприхотливости к среде, малым размерам Регистрация сигнальных молекул - реферат, резвому росту, что позволяет использовать всего один генетический клон в протяжении всего опыта.

1.3. Сигнальные молекулы, их способность индуцировать процессинг тДНК

Экспрессию генов vir-области индуцируют специальные сигнальные молекулы средством положительной регуляции системы в состав которой входят гены virA и virG [Melchers et al., 1986; Stackel, Zambryski, 1986].

Активаторами транскрипции vir-генов Регистрация сигнальных молекул - реферат являются низкомолекулярные моноциклические фенольные соединения, синтезируемые в механически покоробленных тканях растений [Stuchel, 1985]. Примерами таких соединений являются ----------- и достаточно широкий круг производных ------- биосинтетического пути метаболитов защитной природы либо предшественников лигнина.

Сигнальные молекулы были в первый раз обнаружены в экссудатах корней и листьев двудольного растения Nicotiano tabacum, они были идентифицированы Регистрация сигнальных молекул - реферат как ----- и -------. Эти соединения синтезировали метаболически активные покоробленные ткани растений. В текущее время установлена сигнальная индуцирующая активность у большой группы ------- соединений растительной природы. Механическое повреждение тканей растений приводит к усилению синтеза таких сигнальных соединений. Понятно, что ------------ и коричная кислоты, проявляющие сигнальную активность, владеют так же антимикробными качествами и являются Регистрация сигнальных молекул - реферат промежными метаболитами на пути синтеза -------. ---------- распознаются специфичными сенсорами агробактерий, являющимися трансмембранными хеморецептргыми белками с различной ------- к таким молекулам [Leroux, 1987]. Для хорошей индукции экспрессии генов vir требуется присутствие в эксцудатах растений разных углеводов: глюкозы, глюкуроновой кислоты, галактозы, галактуроновой кислоты, арабинозы, маннозы, фукозы, целлобиозы и ксилозы, представляющих составляющие клеточной стены растений Регистрация сигнальных молекул - реферат. Такие углеводы связываются с периплазматическим доменом сенсора в виде за ранее обработанного комплекса с белком-продуктом хромосомного вирулентного гена Chv E, при этом конечный итог индукции процессинга тДНК находится в зависимости от синергической активности сигнальных соединений и сахаров эксцудатов растений.

Структурная формула:

Положительная регуляторная система vir A – vir G Регистрация сигнальных молекул - реферат, контролирующая экспрессию генов vir -----, работает последующим образом. Экспрессируемый конститутивно ген vir A делает функцию рецепции сигнальных молекул растений и коробки этого сигнала в бактериальную клеточку. Этот мембранный хеморецептор после принятия наружного сигнала активирует продукт гена vir G, который в свою очередь выступает в качетве положительного регулятора своей транскрипции и транскрипции других Регистрация сигнальных молекул - реферат генов vir -----. Механизмы активации последующие.

Белок vir A, два раза пронизывающий мембрану бактерии, при возникновении сигнальных молекул автофосфорилируется --------- на собственном С-конце, переходя в активную форму. (В отсутствии индукции С-терминальный домен белки vir A ведут взаимодействие с W-терминальным доменом, ингибируя киназную активность).

Активированный белок vir A Регистрация сигнальных молекул - реферат в свою очередь --------- внутренний клеточный белок – трансдуктор сигнала vir a по остатку аспарагина – 52 [Jin et al., 1990]. Фосфорилированный белок vir G связывается с промоторами других генов регулона и со своим своим, выступая в качестве транскрипционного активатора. Индукция vir генов обратимая, и каскад реакций может быть прерван, что очень принципиально Регистрация сигнальных молекул - реферат для патогена: в случае, если владелец нездоровой и нежизнеспособный организм, перенос тДНК в его клеточки не осуществляется [Hess et al., 1991].

Не считая положительной регуляторной системы vir A – vir G, локализованной на Ti-плазмиде, в регуляции экспрессии vir-генов учавствуют также хромосомные гены. Об этом свидетельствует обнаружение спонтанного хромосомного мутанта ros, у Регистрация сигнальных молекул - реферат которого гены vir C и vir D – оперонов экспрессируются в отсутствие сигнальных молекул растений.


3. Материалы и способы

2.1. Материалы

2.1.1. Оборудование

Копалка, термомиксер 5436, центрифуга "Эппиндорф", прибор для горизонтального электрофореза, источник питания 2197, термостат ТС–80 Мг.

2.1.2. Бактериальные штаммы и плазмиды

Штамм:

Escherichia coli

HB 101

Agrobacterium tumefaciens

C58C1

Плазмиды:

рGV3850

тДНК:

рBR322 маркер Ар, Тс

2.1.3. Растения

В качестве Регистрация сигнальных молекул - реферат объектов исследования использовали 2-ух–, трехмесячное однодольное растение ряски крохотной (Lemna perpusilla).

Растения выращивали в теплице в вегетационных сосудах при температуре 18–250 С и 12 часовом световом периоде. Относительную влажность воздуха в теплице поддерживали в границах 65–70%. Для анализа брали стерильные ткани листьев. Стерилизацию проводили гипохлоридом натрия в течение 5–10 минут, а потом материал 3 раза Регистрация сигнальных молекул - реферат промывали стерильной водой и использовали в опытах по индукции vir–генов Ti–плазмид. Для сопоставления были взяты двудольные растения табака красноватого и льна долгунца.

2.1.4. Среды микробиологические для культивирования растений

В работе использовали среды:

1. Для микробов – LB (Лурия–Бертани)

NaCl

Дрожжевой экстракт

Бантотриптон

10 мг/л

5 г/л

5 г/л

рН 7,5

Температура 240 С

Длина светового денька 16 часов

На чашечку Регистрация сигнальных молекул - реферат Петри:

LB

штамм

10 мл

1 мл

2. Для культивирования растений – среда MS (Мурасиге–Скуча) приведена в таблице.

2.1.5. Другие смеси

Фосфатный буфер

ТЕ буфер (10 мМТрис–HCl (pH 8.0), 1 мМ ЭДТА)

Саркозилат Na

Проназы – 1,5 мг/мл

Оксибензол

Хлороформ

Агарозные гели

Фитогормоны:

БАП (6–бензиламинопурин) растворяли в растворе 0,1 – NaOH

HУК (2–нафтилуксусная кислота) растворяли в этаноле и разводили водой до 10 мг/мл. Стерилизовали фильтрованием через фильтры В 485.

Ацетосирингон растворяли в 70% спирте Регистрация сигнальных молекул - реферат (этаноле) в концентрации 10 мг/мл. Добавляли в среду MS до конечной концентрации 100 мМ.

2.1.6. Ферменты, применяемые в генной инженерии

Гидролиз ДНК проводили рестрикционными эндонуклеазами:

Hind III, Bam Hi, Sal I, Eco RI.

2.1.7. Лекарства

Ампицилин 50, Н2 О 50. Для селекции микробов с определенными плазмидами.

2.2. Способы

2.2.1. Инкубация Agrobacterium tumefaciens с экссудатами тканей растений

Ночную Регистрация сигнальных молекул - реферат культуру A. tumefaciens С58С1 (pGV3850), выращенную на ротационном шейкере (20 циклов/мин) при 290 С в водянистой среде LB, собирали центрифугированием и суспензировали в среде МС – 0,1 М фосфатном буфере (рН 5,5) до кислотности А600 – 0,05.

После 5 часов роста в бактериальную культуру добавляли мелконарезанные стерильные ткани растений (листья, стволы) в количестве 2 г на Регистрация сигнальных молекул - реферат 10 мл среды и продолжали инкубацию в течение 48 часов.

В качетве положительного контроля использовали агробактериальную культуру с добавлением в качестве индуктора 100 мкМ ацетосирингона. В качестве отрицательного контроля использовали агробактериальные клеточки, выращенные на среде без ацетосирингона и эксцудатов растений.

Эффективность индукции процессинга тДНК церез 48 часов инкубации агробактерий с тканями растений. Титр жизнестойких микробов после Регистрация сигнальных молекул - реферат инкубации с эксцудатами растений инспектировали методом их высева в разных разведениях на чашечки Петри с агаризованной средой LB. Каждый вариант опытов проводили в 3-х повторностях.

2.2.2. Выделение полной ДНК Agrobacterium tumefaciens

ДНК выделяли по измененному способу Draper с соавт.Через 48 часов совместного культивирования агробактерий с тканями растений из Регистрация сигнальных молекул - реферат пробирок удаляли растительную ткань, бактерии собирали, центруфугировали при 9000 g. Осадок, полученый из 10 мл инкубационной среды лизировали в течение 45 мин при 370 С в 500 мкл ТЕ буфера (10 мМ трисHCl (pH 8,0), 1 мМ ЭДТА), содержащего 1% сарколизата Na и 1,5 мг/мл проназы. Лизат два раза экстрагировали оксибензолом и два раза хлороформом. ДНК осаждали спиртом и растворяли Регистрация сигнальных молекул - реферат в ТЕ–буфере.

2.2.3. Блод-гибридизация тДНК по Саузерну

В целях дополнительной проверки наличия индукции процессинга и присутствия в пробах pBR322 татальную ДНК агробактерий в количестве 5 мкг наносили в лунки 0,8% агарозного геля и проводили электрофорез при 25–100 В в течение 2 часов в буфере, содержащем: 40 мМ трис–ацетат (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА Регистрация сигнальных молекул - реферат и 5 мкг/мл бромистого этидия. В качестве маркеров молекулярного веса использовали ДНК фага l, гидролизованную рестриктазной эндонуклеазой Hind III. Блод–гибридизацию проводили на ––––– фильтрах. В качестве зонда использвали ДНК плазмиды pBR322, меченную 32 –– при помощи ДНК–полимеразной системы.

2.2.4. Трансформация клеток Esherichia coli

Штаммы E. сoli HB101 выращивали в водянистой среде LB при Регистрация сигнальных молекул - реферат 370 С до концентрации 5*107 клеток/мл (А600 = 0,45). Для количественного исследования процессинга тДНК использовали комплементарные клеточки бесплазмидного штамма E. сoli HB101, которые трансформировали полной ДНК агробактерий, которая была выделена (М-2), претерпевших различную переработку. Трансформанты каждого варианта высевали на три чашечки Петри с агаризированной средой LB, содержащей ампицилин (50 мкг/мл). Количество колоний подсчитывали Регистрация сигнальных молекул - реферат. В контрольных опытах клеточки трансформировали плазмидой pBR322, и другой контроль не был подвергнут трансформации и колоний найдено не было.

3. результаты

Для обнаружения процессинга агробактериальной тДНК, индуцированного экссудатами анализированных растений, в работе применяли способ "спасения плазмиды", предложенный Koukolikova-Nikola с соавт. Этот способ основан на использовании измененной Ti-плазмиды pGV385 [11], содержащей меж Регистрация сигнальных молекул - реферат правой и левой границами существенно делетированной начальной тДНК бактериальной плазмиды вектор pBR322. Таким макаром, индуцирование процессинга тДНК в измененной Ti-плазмиде pGV3850 можно прослеживать по вырезанию из нее низкомолекулярного куска ДНК, в состав которого заходит плазмида pBR322. Этот процесс можно тестировать разными способами. Какой-то из них – это Регистрация сигнальных молекул - реферат трансформация клеток E. сoli полной агробактериальной ДНК и отбор трансформантов по селективным маркерным признакам плазмиды pBR322 – устойчивой к лекарствам. Другим способом может быть блод-гибридизация – анализ тДНК при помощи плазмиды pBR322 в качестве гибридизационного зонда. Оба этих способа были применены в истинной работе. Сравнили эффективность индукции процессинга экссудатами Регистрация сигнальных молекул - реферат разных растений проведено по отношению к активности 100 мкМ ацетосирингона. Понятно, что это токсифенольное соединение, выделяемое некими двудольными растениями, принадлежит к сигнальным молекулам, индуцирующим вырезание и перенос агробактериальной тДНК.

Результаты трансформации клеток E. сoli НВ101 тДНК подвергнутых воздействию экссудатов листьев разных растений представлены в таблице.

Таблица 3.1.

Причины индукции

Количество трансформированных Регистрация сигнальных молекул - реферат E. Coli

L. perpusilla (ряска)

L. perpusilla (ряска)

Ацетосирингон (контроль)

Лен долгунец

Nicotiana tabacum (табак)

Без ацетосирингона и трансформации

25 колоний

30 колоний

35 колоний

40 колоний

30 колоний

Экссудаты листьев ряски индуцировали вырезание тДНК, что является подтверждением присутствия в их составе сигнальных соединений, специфичных для индукции транскрипции генов vir агробактериальной Ti-плазмиды.

Прямой блод-гибридизационный анализ тДНК агробактерий свидетельствует о присутствии у ряски сигнальных Регистрация сигнальных молекул - реферат молекул, индуцирующих образование тДНК [12].

4. обсуждение

Использованный подход позволяет регистрировать присутствие сигнальных молекул в экссудатах разных тканей растений по одному из важных результатов индукции генов области vir, а конкретно по вырезанию тДНК из агробактериальной Ti-плазмиды. В истинной работе мы применили два способа детекции процессинга тДНК измененной агробактериальной Регистрация сигнальных молекул - реферат Ti-плазмиды. PGV3850 [11].

Приобретенные результаты позволяют расширить перечень однодольных растений (на одно растение), синтезирующих сигнальные молекулы, индуцирующие процессинг агробактериальной тДНК. Примененный способ "спасения плазмиды" позволяет выявлять возникновение повторяющихся форм измененной тДНК pBR322 и ее линейных форм [20].

Рассмотренный в работе способ позволяет учесть присутствие в экссудатах растений веществ с бактериостатической активностью. Вещества таковой Регистрация сигнальных молекул - реферат природы могут значительно оказывать влияние на эффективность трансформации растений агробактериями.

Мы не анализировали хим природу сигнальных молекул ряски. Не исключено, что сигнальные молекулы могут отличаться от сигнальных фенольных соединений двудольных растений. Специфичный процесс взаимодействия меж агробактериями и покрытосеменными растениями существовал, по-видимому, еще до их дивергенции на двудольные Регистрация сигнальных молекул - реферат и однодольные [15].

Штаммы агробактерий владеют многими особенностями и конкретно сенсоры (продукты гена vir A), различающиеся по возможности узнавать сигнальные молекулы различной природы.

Необходимо подчеркнуть, что растительные вещества с сигнальной функцией для агробактерий не является уникальным примером существования соединений, выполняющих эту важную роль во содействии микробов с растенями [22].

Молекулярные сигналы растений Регистрация сигнальных молекул - реферат играют важную роль в установлении паразитарных и симбиотических отношений меж микробами и растениями, определяя при всем этом круг растений для определенного мельчайшего организма. Всесторонние структурно-функциональные исследования специфичных молекулярных сигналов во содействии меж микробами и растениями должны ответить на бессчетные вопросы о молекулярно-генетических механизмах этих отношений Регистрация сигнальных молекул - реферат и содействовать развитию действенных способов генетической инженерии важных сельскохозяйственных и экологически-индикаторных культурах растений (как ряска).


Перечень литературы

1.

2.

3.

4.

5

6.

7.

8.

9.

10.

Анализ генома. Способы . Под ред. Н. Дейвиса. – М.: Мир, 1990. – 247 с.

Великов В.А., Бурьянов Я.И. Образование делеционных производных Ti- плазмиды pGV3850 при конъюгационном переносе из Agrobacterium tumefaciens в Escherichia coli. // Генетика.1998. №8. т Регистрация сигнальных молекул - реферат. 34. с. 1056-1062.

Великов В.А., Бурьянов Я.И. Исследование конъюгационного транспорта Ti- плазмиды pGV3850 из Agrobacterium tumefaciens в Escherichia coli. // Тезисы докладов III Пущинской конференции юных ученых. Пущино, 27-30 апреля 1998 г, с. 49.

Генная инженерия растений. Лабораторное управление. – М.: Мир, 1991. – 408 с.

Клонирование ДНК. Способы . Под ред. Д. Гловера. – М.: Мир, 1988. – 538 с.

Малиатис Регистрация сигнальных молекул - реферат Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Способы генетической инженерии. – М.:Мир, 1984. – 463 с.

Способы молекулярной генетики и генной инженерии. Под ред. А.И. ----. – Новосибирск: Наука, 1990. – 248 с.

Мобильность генома растений. Под ред. Б. Хол и Е.С. Делинс. – М.: Агропромиздат, 1990. – 272 с.

Плазмиды. Способы. Под ред. Д. Хорда. – М Регистрация сигнальных молекул - реферат.: Агропромиздат, 1990. – 272 с.

Пехов А.П. Базы плазмидологии .- М.: 1996. – 231 с.

Сельскохозяйственная биотехнология. Векторные системы молекулярного клонирования. Под ред. Р.Л. Подреперс и Д.Т. Денхардт. – М.: Агропромиздат, 1991. – 535 с.

Солова Г.К., Кривопалов Ю.В., Великов В.А., Чумаков М.И. Прикрепление Agrobacterium к корням пшеницы. // Микробиология. 1995. т. 64. №4, с. 526-530.

Захарченко Н.С., Комиви М Регистрация сигнальных молекул - реферат.А., Бурьянов Я.И. Индуцирование процессинга тДНК. // Физиология растений. 1999. т. 46. № 2, - с. 282-291.

Baker R.F., Idler I.B. and al. Nucleotide sequence of the tDNA region from Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid pTi / 5955. Plant Mol. Biol., 1983, V.2, pp. 335-350.

Douglas C.J and al. Identification and genetic analisys of an Agrobacterium tumefaciens Регистрация сигнальных молекул - реферат chromosomal virulence rigion. J. Bacteriol., 1985, v. 161, pp. 850-860.

Holster S.M., Villaroel and al. An analisys of the boundaries of the octopine TL – DNA intumors induced by Agrobacterium tumefacies. Mol. Gen. Genet., 1983, v. 190, pp. 35-38.

Howord E.A., Zupan J.R. and al. The vir Dr protein of A. Tumefaciens contaen Регистрация сигнальных молекул - реферат sal-terminal bipartite nuclear localization sygnal: implication for nuclear uptake of DNA in plant cells. Cell, 1992, v. 68, pp. 109-119.

Janssens A., Engler., Zambryski P. The nopaline c58 tDNA region is teansribed in Agrobacterium tumefaciens., Mol. Gen. Genet., 1984, v. 195, pp. 341-350.

Melchers L.S., Hooykaas P.J.J., virulence in Agrobacterium tumefaciens Регистрация сигнальных молекул - реферат. Oxford Surv. Plant Mol. Cell Biol., 1987. № 4. pp. 167-170.

Stachel S.E., Nester E.W. The genetic and transcriptional organization of the vir regulon of the A6 Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens. EMBO J., v. 5, pp. 1145-1454.

Zambryski P., Joos N., Genetello G., Leemans. Ti plasmid veefof for the Регистрация сигнальных молекул - реферат introduction of DNA in to plant cells without alteration of their normal regeneration Capacity. EMBO J., 1983. v. 2, pp. 2143-2150.


regionalnij-komponent-v-sootvetstvii-s-resheniem-pedagogicheskogo-soveta-gou-npo-professionalnoe-uchilishe-31.html
regionalnij-konkurs-metodicheskih-razrabotok-urokov-i-programm-elektivnih-kursov-samojlova-nina-andreevna.html
regionalnij-konkurs-provoditsya-v-dva-etapa-2-pervij-otborochnij-etap-zaochnij-otbor-konkursantov-po-predvaritelno-oformlennim-zayavkam-uchastnikov.html